体外皮肤致敏-直接多肽结合法 (DPRA)检测

引言

皮肤致敏是一种常见的过敏反应，当人体皮肤反复暴露于某些化学物质（如化妆品成分、工业化学品或药物添加剂）时，可能引发免疫系统的过度反应，导致红肿、瘙痒等症状。传统的皮肤致敏测试往往依赖于动物模型，这不仅引发严重的伦理争议，还存在成本高、周期长和跨物种预测偏差等问题。随着“3R原则”（替代、减少、精炼）在全球的推广，体外替代方法逐渐成为研究热点。其中，体外皮肤致敏-直接多肽结合法（Direct Peptide Reactivity Assay, DPRA）作为一种高效、可靠的预测工具，在近年来被广泛用于评估化学物质的致敏潜力。DPRA通过模拟化学物质与皮肤蛋白的相互作用，能够定量检测其反应性，从而在药物开发、化妆品安全评估和化学品监管中发挥关键作用。相较于体内测试，DPRA具有快速（通常24-48小时）、低成本、高重现性和减少动物使用等优势，使其成为OECD（经济合作与发展组织）推荐的标准化方法之一。随着全球对可持续发展目标的追求，DPRA检测的应用前景日益广阔，为保护消费者健康和推动绿色化学做出了重要贡献。

检测项目

DPRA检测的核心项目是评估化学物质是否具有皮肤致敏潜力，通过体外模拟化学物质与皮肤蛋白多肽的结合反应来预测其致敏性。具体而言，该项目专注于测量化学物质（如半抗原）与特定多肽（如半胱氨酸肽或赖氨酸肽）的共价结合能力，这种结合是皮肤致敏反应的关键初始步骤。检测项目通常针对各类化学物质进行，包括但不限于化妆品成分（如香料、防腐剂）、工业化学品（如染料、聚合物单体）、农药和药物辅料。其目的是预测这些物质在人体皮肤中是否会形成完全抗原，从而触发T细胞介导的过敏反应。DPRA检测项目的优势在于其高特异性和预测准确性，能够区分强致敏物（如对苯二胺）和非致敏物（如甘油），为风险评估提供可靠依据。通过该项目，研究人员可以快速筛选出潜在致癌物，支持产品安全标签的制定和监管决策。

检测方法

直接多肽结合法（DPRA）是一种基于化学反应的体外检测技术，其核心方法是通过高效液相色谱（HPLC）分析化学物质与多肽的结合程度。具体方法步骤如下：首先，准备两种特定的合成多肽，即含半胱氨酸的肽（Cys-peptide）和含赖氨酸的肽（Lys-peptide），这些肽段模拟皮肤蛋白的活性位点。然后，将测试化学物质与这些多肽在缓冲溶液（如磷酸盐缓冲液）中孵育，通常在37°C下进行24小时，以模拟生理条件下的反应。孵育后，使用HPLC系统分析反应混合物，通过紫外检测器测量多肽残留量；结合程度通过计算多肽的消耗率来量化，公式为：消耗率（%）= [（初始多肽浓度 - 残留多肽浓度）/ 初始多肽浓度] × 100%。根据消耗率的高低，将化学物质分类为高反应性（消耗率>50%）、中反应性（10-50%）或低反应性（<10%），从而预测其致敏潜力。该方法的关键在于标准化操作，包括严格的对照设置（如溶剂对照和阳性/阴性对照）、重复实验以确保重现性，以及使用自动化的HPLC设备提高精度。DPRA方法的优势是简便快速，避免了复杂的细胞培养步骤，同时能处理多个样本并行测试。

检测标准

DPRA检测的标准化是确保结果可靠性和国际可比性的基础，主要遵循由OECD（经济合作与发展组织）制定的Test Guideline 442C（TG 442C）。该标准于2015年正式发布，详细规定了DPRA检测的protocol、质量控制要求和数据解读准则。标准内容涵盖多个方面：首先，要求使用特定的多肽序列（如Ac-RFAACAA-COOH for Cys-peptide and Ac-RFAAAAA-COOH for Lys-peptide），并指定其来源和纯度标准（如HPLC纯度>95%）。其次，对实验条件进行严格规范，包括孵育时间（24小时）、温度（37°C）、缓冲液pH（7.0-7.4）和化学物质浓度（通常100 mM），以避免偏差。数据评估方面，TG 442C定义了明确的分类阈值：消耗率>6.38% for Cys-peptide或>2.75% for Lys-peptide时，化学物质被视为具有致敏潜力；同时，标准要求进行至少三次独立实验，并报告RSD（相对标准偏差）以验证精度。此外，检测标准还包括验证程序，如使用参考物质（如2,4-二硝基氯苯为阳性对照，水杨酸为阴性对照）进行校准。在全球范围内，DPRA检测还涉及其他标准体系，如欧盟REACH法规和ISO相关指南，确保其适用于化学品注册和产品安全认证。遵守这些标准不仅提高了检测的可信度，还促进了方法的全球 harmonization。

总之，体外皮肤致敏-直接多肽结合法（DPRA）作为一项先进的预测工具，通过标准化的项目、方法和标准，有效替代了传统动物测试，推动了伦理安全评估的发展。它将继续在化学品安全领域发挥核心作用，支持可持续创新。